Travaux dirigés: hybridation moléculaire et PCR

 

Exercice 8

 

8- Amplification spécifique de séquence (PCR)

On souhaite amplifier par PCR une partie de la séquence (donnée ci-dessous) du gène de la ß-6 tubuline du maïs.
Rappel: la taille du génome haploïde du maïs est de 5 e+9 pb
       1 ttttaagtta ctgtgtgctt gttgcaggat ctgtaactaa ttcctatgcg attctcttgt
       61 ttgtagggcg aagatgaggg agatcctgca catccaggga gggcaatgtg gcaaccagat
      121 tggcgccaag ttctgggagg tggtgtgcga tgaacatggc attgacccta ccgggcggta
      181 cactggcaat tccgaccttc agttggagcg tgttaatgtc tactacaatg aagcctcctg
      241 cggacgcttt gttccccgcg ctgttctcat ggatcttgag cctgggacaa tggacagtgt
      301 ccggaccgga ccctatgggc agatcttccg ccctgacaac tttgtgtttg ggcaatctgg
      361 tgctggtaac aattgggcta agggccacta caccgagggt gctgagctca ttgactctgt
      421 tctggatgtt gtgaggaagg aagctgagaa ctgtgactgc ttgcaaggat tccaagtatg
      481 ccactccctt ggtggtggta ctggatctgg tatgggtacg ctgttgatct caaagatcag
      541 ggaagagtac cctgaccgca tgatgcttac attctcagtt ttcccctcac cgaaagtatc
      601 tgataccgtg gttgagccat acaatgccac tctttctgtc caccagttgg tcgagaatgc
      661 tgatgagtgc atggttctcg ataacgaagc cctctatgac atctgcttca ggactcttaa
      721 gctgaccacc cctagctttg gtgatctgaa ccatttgatc tctgcaacca tgagtggagt
      781 cacctgctgc ctaaggttcc ctggtcagct gaactccgac ctcaggaagc tggcagtgaa
      841 cctgatcccc ttcccccgtc tccacttctt catggtcggc ttcgcgccgc tgacgtcccg
      901 tggctcccag cagtaccggg ccctcacagt ccccgagctc acgcagcaga tgtgggatgc
      961 caagaacatg atgtgtgccg ctgaccctcg ccatgggcgt tacctcaccg cctcggccat
     1021 gttccgcggg aagatgagca ccaaggaggt tgacgagcag atgatcaacg tccagaacaa
     1081 gaactcgtcc tacttcgtgg agtggatccc caacaacgtc aagtccagcg tgtgcgacat
     1141 cccgcccagg ggcctgtcca tggcgtccac cttcatcggc aactcgacct ccatccagga
     1201 gatgttccgg agggtgagcg agcagttcac tgccatgttc aggaggaagg ctttcttgca
     1261 ctggtacacg ggcgagggca tggacgagat ggagttcacc gaggccgaga gcaacatgaa
     1321 cgacctcgtg tcggagtacc agcagtacca ggacgcgact gccgacgagg aggagtacga
     1381 ggacgaggag gaggtgcagg ccgatgacat gtgaggggag ggctgttatc gtgtgaagcc
     1441 ttgtggtccc tagggcaagc ggacctcgat gagttcggtg ttccctttcg tgttgttgcc
     1501 atctttctac tgctagcgta cccaccctcg tggcccattc cgtcgctgtt gacgtatgta
     1561 tttttcttgt gctatggaac cttgcttttg gtacggtact atcctgctag tatgcttggc
     1621 gtttgaggtt cctggcgtga atttaagcct tccgtatgca gtgattggag ttggagaccg
     1681 gctgcttcgt ccaggcgaag caattgacag cgacgtgcta tacactcaag
a- Déterminez la séquence de deux amorces utilisables pour amplifier de façon spécifique environ 1 kilobase de la séquence du gène de la tubuline.

b- Calculez la température de fusion (Tm) de chacune de ces deux amorces.

c- Proposez un protocole d'amplification (température et durée des différentes étapes).

d- Calculez le nombre de cycles théoriquement nécessaires pour obtenir 1 µg de ce fragment en partant soit de 10 ng, soit de 500 ng d'ADN génomique.

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Réponse à l'exercice